William Dafoe nasce il 22 luglio 1955 ad Appleton, nel Wisconsin. A 17 anni si iscrive alla University of Wisconsin in Milwaukee. Dopo essersi messo in luce nel dipartimento teatrale dell'università, si unisce al gruppo accademico sperimentale chiamato Theatre X troupe. Viaggia frequentemente in Europa, prima di trasferirsi a New York nel 1977.
Debutta a livello cinematografico nel 1981 con il film "Heaven's Gate" di Michael Cimino. Appare in celebri pellicole come "Vivere e morire a Los Angeles" di William Friedkin e "Platoon" di Oliver Stone. Quindi, nel 1988 affianca Gene Hackman in "Missisippi Burning - Le radici dell'odio" ed interpreta il Gesù di Martin Scorzese in "L'ultima tentazione di Cristo". Passa un anno e Dafoe rinnova la sua collaborazione con Stone, girando insieme a Tom Cruise "Nato il quattro luglio". Nel 1990 David Lynch lo contatta per assegnargli una parte centrale in "Cuore selvaggio", mentre nel 1992 gira con Madonna "Body of Evidence". Prende parte al progetto di Wim Wenders "Così lontano, così vicino" ed interpreta il poeta T.S. Eliot nell'autobiografico "Tom and Viv". Dopo "Il paziente inglese", "Lulu on the Bridge" e l'acclamato '"Affliction", nel 1999 l'attore decide di lavorare con il canadese David Cronenberg nel visionario "Existenz". Nel 2000 almeno tre sono i lavori degni di nota: "Animal factory", "American Psycho" e "L'ombra del vampiro" che gli è valsa la nomination come migliore attore non protagonista ai Golden Globe e agli oscar 2000.
Dafoe, infine, ha deciso di indossare le vesti del cattivo Green Goblin nel primo "Spiderman". Recentemente ha girato "In Ostaggio" (2004) insieme a Robert Redford, "Manderlay" (2005) presentato in concorso al 58mo Festival di Cannes e "Xxx 2 : The Next Level".
Ha lavorato alla pellicola "Inside Man" (2006) di Spike Lee, "Mr. Bean's Holiday" (2007) e "Go go Tales" (2005) di Abel Ferrara.
Ha girato il film drammatico "Fireflies in the Garden" (2008) di Dennis Lee, presentato al 58mo Festival di Berlino e la pellicola "Antichrist" (2009).
Inoltre è nel cast del film "The Dust of Time" (2009) di Theo Angelopoulos.