Jackson si trova a combattere fin dall'infanzia con la balbuzie, ma un logoterapista gli suggerisce di affrontare comunque un'audizione per una rappresentazione al college e il rimedio funziona così bene, che Jackson non solo ottiene la parte, ma non smette più di recitare. Ottiene quindi i primi contratti per alcuni spot pubblicitari e fa la sua prima apparizione in un film "Together for Days" (1972), poi si trasfersce a New York, dove entra nella compagnia teatrale Negro Ensemble. Quando si vede estromesso da una parte di primo piano a Broadway, a causa della sua crescente dipendenza dall'alcool e dalla cocaina, Jackson decide di dare una svolta alla sua vita. L'occasione del riscatto gli viene da Spike Lee, con il quale ha già lavorato in "Fà la cosa giusta" e in "Mo' Better Blues".
Il suo primo ruolo, una volta disintossicato è quello di un personaggio perennemente imbottito di crack, in "Jungle Fever" (1991), diretto da Lee. Un ruolo che impressiona a tal punto la giuria del Festival di Cannes, da spingerla ad attribuire a Jackson un premio speciale come migliore attore non protagonista, mai assegnato a Cannes prima d'allora. Al successo, però, Jackson giunge nel 1994, con "Pulp Fiction" di Quentin Tarantino, in cui è Jules Winnfield, il gangster che recita alle sue vittime il Libro di Ezechiele.
E' così che arriva la prima nomination all'Oscar come miglior attore non protagonista. Raggiunta la notorietà, Jackson recita ancora in ruoli di primo piano come nel film "Die Hard - Duri a morire" (1995), ne "Il momento di uccidere" (1996) e poi di nuovo in un film di Tarantino, "Jackie Brown" (1997), in cui è il trafficante d'armi Ordell Robbie.
Ha poi ricoperto il ruolo di protagonista ne "Il negoziatore" (1998), e nel 1999, Jackson ha partecipato all'attesissimo "Star Wars Episodio 1 - La minaccia fantasma". Nel 2002 è la volta di altri tre film: "No Good Deed - Inganni Svelati", "Xxx" e "Ipotesi di Reato".
E' accanto a Colin Farrell in "S.w.a.t. - Squadra Speciale Anticrimine" e con Andi Garcia in "La tela dell'assassino"(2004).
Ha lavorato in due sequel: con il regista Lee Tamahori in "Xxx 2: The Next Level" e con George Lucas in "Star Wars Episodio III - la Vendetta dei Sith".
Inoltre è stato protagonista della pellicola "Coach Carter"(2005) e del film "Freedomland" (2006).
Ha interpretato Cox nel film fantasy "Jumper" (2008) ed è il cattivo Octopus nel film "The Spirit" (2009) di Frank Miller.